常见问题

问：原代细胞和细胞系有什么区别？

原代细胞直接来源于组织，在培养后具有有限的生命周期。原代细胞之所以具有研究价值，是因为它们能够保留许多在体内观察到的标志物。细胞系是能够持续生长和复制的细胞群体，并且通常经历了遗传转化，因此具有无限增殖的潜力。细胞系可在体外长期维持，用于医学和/或科研目的。细胞系可以经过大量传代，但在非常高的传代次数下，可能会发生进一步的基因型和表型变化。一般而言，细胞系缺乏许多体内细胞所具有的标志物，其标志物表达谱也与原代细胞存在明显差异。

问：ScienCell 如何确认细胞类型？

我们通过多种方式确认细胞类型。细胞形态非常重要，可帮助我们识别正确的细胞类型。此外，我们的质量控制部门使用免疫荧光检测来确认特定细胞类型的标志物是否存在。免疫荧光也可用于识别污染细胞。

问：我可以获得我的细胞批次的哪些供体信息？

我们保存所有人源和动物原代细胞的相关记录。如果您有特定要求（如年龄和/或性别），请在订购前联系我们的客户服务部门。

问：ScienCell 是否对细胞进行人类白细胞抗原（HLA）分型？

我们的许多原代细胞都经过 HLA 分型，您可以提出对特定 HLA 类型的需求。我们可能有多个供体可供选择，其中最常见的是 HLA-A 分型。此外，我们还可以为尚未进行分型的供体提供 HLA 分型服务，包括 HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPB1、HLA-DQB1 和 HLA-DRB1。

问：我的一支原代细胞是否会达到 100% 纯度？

原代细胞不可能达到 100% 纯度，但我们会尽可能提高细胞纯度。样品中始终可能存在污染细胞。

问：开始使用正常原代细胞需要多少经验？

强烈建议您具备在无菌条件下使用层流罩进行操作的经验，同时拥有其他细胞类型的培养经验也会有所帮助。如果您是细胞培养初学者，或希望建立细胞培养实验室，我们可以为您提供协助。请联系我们的细胞培养专家。

问：收到冻存细胞后应该如何处理？

收到包裹后，请立即将冻存细胞从干冰运输容器转移至液氮中。应快速完成从运输容器到液氮的转移，以防止细胞解冻。请勿将细胞储存在 -20°C 或 -80°C，因为这会对细胞造成不可逆的损伤。

问：首次接种冻存细胞时，是否需要离心去除 DMSO？

我们不建议通过离心去除 DMSO 残留。离心过程可能比 DMSO 残留对细胞造成更大的伤害，尤其是在使用不适当的高速离心时。将细胞接种到培养基中后，DMSO 会得到充分稀释。例如，将整支冻存管（1 毫升）细胞接种到含有 15 ml 培养基的 T-75 培养瓶中，DMSO 浓度将低于 0.67%（v/v）。如果按照 5000–10,000 个细胞/cm² 的密度接种，DMSO 浓度会更低。

问：培养 ScienCell 原代细胞应该使用什么类型的培养箱？

我们建议使用 37°C、5% CO₂ 培养箱培养 ScienCell 的所有原代细胞。所有 ScienCell 培养基都需要 5% CO₂ 来维持细胞所需的最佳 pH。

问：如何从冻存细胞建立细胞培养？

问：细胞培养瓶中应该加入多少培养基？

建议 T-25 培养瓶加入 5 ml 培养基，T-75 培养瓶加入 15 ml 培养基，T-150 培养瓶加入 30 ml 培养基。

问：原代细胞的培养基多久更换一次？

具体操作请参阅所培养细胞类型的产品说明书。一般情况下，应根据细胞融合度每 2–3 天更换一次培养基。注意：冻存细胞解冻并接种后，第一次换液应在约 16 小时后进行，以去除残留 DMSO 和死亡细胞。

问：细胞达到多少融合度时应该传代？

这取决于细胞类型。例如，内皮细胞不应达到过高的融合度（90%–100%），因为这可能促进污染细胞生长并导致内皮细胞衰老。另一方面，成纤维细胞可以在较高融合度（90%–98%）下进行传代，并且通常不会因较高的融合度而受到明显影响。一般而言，原代细胞不应达到过高融合度，因为这可能导致细胞衰老并促进污染细胞生长。

问：正常原代细胞推荐的传代比例是多少？

ScienCell Research Laboratories 不建议为正常细胞指定固定的传代比例，因为胰酶消化后细胞数量会有所不同。我们建议在胰酶消化后对细胞进行计数，并按照相应细胞类型产品说明书推荐的接种密度进行接种。

问：群体倍增和传代次数有什么区别？

群体倍增是指培养物中的细胞总数增加一倍，通常用于描述细胞指数生长期（即“对数期”）的增长。传代次数则是指细胞群体从培养器皿中取出并进行一次再培养（传代）的次数，其目的是使细胞保持在足够低的密度，以促进进一步生长。

问：正常原代细胞可以进行多少次传代？

ScienCell 不使用“传代次数”来描述细胞的生长潜力，因为不同客户所使用的传代比例不同。ScienCell Research Laboratories 会在细胞产品说明书中注明预期的群体倍增次数。

问：不增殖的细胞可以传代培养吗？

不增殖的细胞无法进行传代培养，因为它们不会增殖。这包括神经元、小胶质细胞、巨噬细胞以及其他少数细胞类型。产品说明书会注明相应细胞是否属于不增殖细胞。

问：可以将 ScienCell 的正常原代细胞重新冻存吗？

我们不建议客户重新冻存 ScienCell 的人源和动物原代细胞。

问：我们的正常野生型小鼠和大鼠来自哪家公司？

Charles River Laboratories International。

问：ScienCell 的大鼠细胞使用什么品系？其遗传背景是什么？

我们使用从 Charles River 获得的 CD IGS 大鼠，该品系属于远交大鼠。CD IGS 大鼠于 1925 年由 Robert Dawley 使用一只杂交带帽雄性大鼠和一只 Wistar 雌性大鼠培育而来。IGS 是指按照 Charles River International Genetic Standard 系统繁育的动物。

问：CD-1 小鼠和 C57Bl/6 小鼠有什么区别？

CD-1 IGS 小鼠属于远交小鼠，来源于在瑞士洛桑抗癌中心培育的一组远交 Swiss 小鼠。它们于 1926 年引入美国，并于 1959 年引入 Charles River。C57BL/6 小鼠属于近交小鼠，由 C.C. Little 于 1921 年在 Bussey Institute for Research in Applied Biology 培育。C57BL/6 小鼠被广泛用于转基因/基因敲除模型开发，其中野生型小鼠可作为良好对照。

问：可以获得培养基样品吗？

我们不提供培养基样品（STEMium® 除外——客户需承担运输和处理费用）。

问：可以使用自己的培养基或其他商业培养基培养 ScienCell 的正常人源细胞吗？

ScienCell 的正常人源细胞均在我们的完全培养基中培养和测试，并已经适应该配方。由于细胞的适应过程，使用其他培养基培养 ScienCell 的正常人源细胞可能会导致不理想的生长结果。我们建议使用针对正常人源细胞配制的 ScienCell 专用培养基。

问：使用你们的专用培养基时是否需要额外添加培养基补充剂？

ScienCell 专用培养基套装包含所有必要组分。根据培养基类型，在使用前可能需要向基础培养基中加入冻存的生长补充剂、Pen/Strep 和 FBS。

问：培养基和生长补充剂的保质期是多久？

培养基和补充剂不应在标签标示的有效期之后使用。在混合之前，培养基自生产日期起保质期为 2 年，补充剂自生产日期起保质期同样为 2 年。

问：ScienCell 培养基是否同时适用于人源和动物原代细胞？

大多数专用培养基均针对人源细胞开发和优化，因此不保证适用于动物细胞。ScienCell 也提供一些针对动物细胞优化的专用培养基，例如 Epithelial Cell Medium-animal（EpiCM-a）和 Astrocyte Medium-animal（AM-a）。如果您购买的是 ScienCell 动物细胞，请使用针对该细胞类型推荐的 ScienCell 培养基。

问：培养基配制后多久需要使用？

向基础培养基中加入补充剂后，如果在 4°C 避光保存，可使用 1 个月。

问：可以将生长补充剂重新分装并冻存，以便以后使用吗？

我们不建议对生长补充剂进行冻融循环，因为这可能导致其中组分活性降低，并可能造成某些组分不可逆沉淀。

问：可以将 ScienCell 生长培养基冻存进行长期保存吗？

我们不建议冻存培养基，因为这可能导致培养基组分发生不可逆沉淀。

问：可以在不添加 FBS 和/或生长补充剂的情况下使用专用基础培养基培养 ScienCell 原代细胞吗？

我们不建议从专用培养基套装中省略 FBS 和生长补充剂。专用培养基经过优化，包含这些组分，以支持其针对的原代细胞生长。与细胞系不同，原代细胞需要这些复杂的培养基组分才能生长和存活。缺少这些组分会严重影响细胞活力和生长。

问：如果不小心将 FBS 放在 37°C 水浴中解冻了一整晚，还能使用吗？可能会发生什么？

由于 FBS 中许多组分在该温度下不稳定，在 37°C 下放置过夜的 FBS 不应继续使用。

问：我的 FBS 中可以看到絮状物，这是正常的吗？

FBS 中出现絮状物是由脂蛋白沉淀引起的，这是正常现象，不会对细胞造成危害。如果客户希望去除 FBS 中的沉淀，可以在 400g 下短时间离心后取上清液，但通常没有必要这样做。

问：可以获得多个批次的培养基或补充剂进行比较，并在选择理想批次前将这些批次保留吗？

我们不提供样品，但对于大多数产品，客户可以出于测试目的申请多个批次。测试期间，我们可能可以为客户保留有限数量的库存，但请在下单前先咨询。

问：是否应该记录产品批号？

信息越完整越好。在条件允许的情况下，我们建议客户记录产品批号。可以通过撕下产品标签并保存到记录本中来轻松完成。虽然这并非强制要求，但如果出现问题，这些信息可以帮助我们进行评估。

问：干细胞可以传代多少次？

这取决于干细胞类型。对于来源于囊胚内细胞团或通过转录因子由体细胞诱导产生的多能干细胞，hPSC 可以无限期地进行自我更新。来源于成人组织的干细胞或祖细胞通常具有有限的自我更新能力，并最终发生分化，例如神经祖细胞。我们的人间充质干细胞保证可达到 15 次群体倍增。

问：STEMium® Human Pluripotent Stem Cell Growth Medium（Cat. 5801）与其他商业干细胞培养基（如 mTeSR™1）相比如何？

STEMium® 与 mTeSR™、Nutristem 和 Stempro 培养基类似，均可在无饲养层条件下培养 hPSC，无需小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层。与 mTeSR 类似，STEMium® 可以维持人胚胎干细胞（hESC）和人诱导多能干细胞系（hiPSC）的多能性。在 STEMium® 中培养的人多能干细胞（hPSC）能够自我更新，并分化形成三个胚层。

问：hPSC 来源的心肌细胞（Cat. 6240）可以扩增、传代和冻存吗？

我们不建议对 hPSC 来源的心肌细胞进行扩增、传代或重新冻存。

问：对于茜素红 S 染色定量检测试剂盒（Cat. #8678），可以使用 3.7% 多聚甲醛代替 PBS 中的 4% 多聚甲醛固定细胞吗？

我们建议使用 4% 多聚甲醛，但也可以使用 3.7% 甲醛替代固定细胞。

问：可以使用质粒 DNA 转染正常人源细胞吗？转染效率是多少？

可以，但总体而言，正常人源细胞比细胞系更难进行转染，且转染效率因细胞类型而异。ScienCell 提供针对特定细胞类型的转染试剂。

问：我们的总 RNA 产品可以用于基因芯片（microarray）吗？

可以。我们的分子生物学产品已经通过质量控制，具有较高质量，适用于基因芯片等应用。

问：转染后多久应该读取荧光素酶信号？

通常在转染后 24–48 小时读取，此时报告基因表达接近峰值。最佳时间点可能因细胞系而异，因此建议针对具体细胞通过实验确定最佳检测时间。

问：可以使用哪些细胞系（HEK293、HeLa 等）？

这些载体兼容常用的哺乳动物细胞系，例如 HEK293T、HeLa 和 NIH3T3。在条件允许的情况下，建议使用通路特异性或响应型细胞系（例如用于 TCF/LEF 报告基因的 Wnt 响应细胞），因为它们可以提供更强且更特异的信号。

问：是否需要针对特定通路（Wnt、NF-κB）使用激活剂？

是的。例如，CHIR99021（一种小分子 GSK 3 抑制剂）常用于激活 Wnt/β-catenin/T cell factor 通路，而 TNFα（一种促炎细胞因子）广泛用于激活 NF-κB 信号通路。最佳浓度取决于细胞系和实验条件，因此建议进行剂量-反应优化。

问：这些载体可以用于原代细胞吗？

可以，但必须仔细优化转染条件。原代细胞通常需要电穿孔或核转染等特殊方法，并且与永生化细胞系相比，其转染效率可能较低。

问：为什么使用 Renilla luciferase 作为内参？

Renilla luciferase 可作为同一孔中的内部归一化对照，用于校正不同样品之间转染效率、细胞数量和裂解效率的差异。

问：应该按照什么顺序读取 Firefly 和 Renilla 信号？

首先读取 Firefly luciferase，然后依次测量 Renilla luciferase。请使用双荧光素酶检测系统，例如 Luciferase Assay Kit（LAK，Cat. #9048），该试剂盒提供用于检测 Firefly 的第一种试剂，以及能够淬灭 Firefly 信号并激活 Renilla 的第二种试剂，并按照试剂盒说明书操作。

问：Firefly 活性会干扰 Renilla 的测量吗？

在正确使用双荧光素酶系统并依次进行淬灭的情况下，干扰通常很小。第一种试剂用于检测 Firefly，第二种试剂淬灭 Firefly 并激活 Renilla。正确的试剂体积、孵育时间和检测顺序有助于防止残留 Firefly 信号影响 Renilla 测量。

问：可以将裂解液冻存，之后再进行检测吗？

为了获得最佳灵敏度，建议检测新鲜制备的裂解液。冻融可能导致 Firefly luciferase 活性下降的程度高于 Renilla，尽管两种报告基因的信号都可能随时间出现一定程度的损失。

问：推荐使用哪种转染试剂？

推荐使用 UniFectagen（UniF，Cat. #0983），其针对 HEK293T 细胞中的报告基因检测进行了优化，在优化条件下通常可以获得较高的转染效率。将 DNA 与 UniFectagen 混合于 Transfection Max Medium（TMM，Cat. #9051）中，在室温下孵育 15–20 分钟，使其形成复合物，然后将复合物直接加入细胞中。

问：转染过程中必须使用无血清培养基吗？

无血清培养基并非严格必需，但在 DNA–转染试剂复合物形成过程中强烈建议使用，因为血清成分可能干扰复合物形成并降低转染效率。在复合物形成过程中使用 Transfection Max Medium（TMM，Cat. #9051），通常比含血清培养基获得更高的转染效率。

问：抗生素会对转染产生什么影响？

复合物形成后，培养基中的低浓度抗生素通常对转染效率影响很小。但是，在 Transfection Max Medium（TMM，Cat. #9051）中形成 DNA–UniFectagen 复合物时，应避免使用抗生素，因为抗生素可能增加细胞毒性，或使某些细胞系的转染效率略有下降。

问：该转染方法可以用于悬浮细胞吗？

可以。UniFectagen（UniF，Cat. #0983）可用于转染悬浮细胞系，但转染效率和细胞活力可能因细胞类型而异。建议针对每种悬浮细胞系优化 DNA 用量、试剂比例、细胞密度和孵育时间。

问：转染时最佳细胞融合度是多少？

对于贴壁细胞，建议在转染时达到 70–90% 的融合度，并确保细胞处于健康的对数生长期。过度融合或细胞密度过低都会降低转染效率。

问：信号非常低，应该怎么办？

首先确认转染效率、细胞状态以及转染后的检测时间，并确保裂解充分且均匀。使用标准化系统，例如 Transfection Max Medium（TMM，Cat. #9051）与 UniFectagen（UniF，Cat. #0983）组合，同时配合 Luciferase Assay Kit（LAK，Cat. #9048）和 Firefly Assay Enhancer 100X（FAE，Cat. #7208），与未经优化的条件相比，可以显著提高 Firefly 信号强度。

问：我的 Firefly 信号较低，可以怎么办？

确认转染时细胞处于最佳融合度（通常为 70–90%），转染效率较高，并且所有孔中的裂解均充分且均匀。进一步改善可以通过优化 DNA/试剂比例、延长表达时间、使用更强的启动子，或在 Luciferase Assay Kit（LAK，Cat. #9048）中加入 Firefly Assay Enhancer 100X（FAE，Cat. #7208）来实现。

问：Luciferase Assay Kit 阴性对照中的背景信号过高可能是什么原因？

高背景可能是由于仅使用未转染孔而没有设置专用阴性对照质粒，或者裂解条件过于剧烈造成的。请使用随附的阴性对照载体；使用 Luciferase Assay Kit（LAK，Cat. #9048）时，可缩短裂解时间或降低振荡强度，并检查是否存在污染或构建体中存在非预期的启动子活性。

问：细胞或裂解液冻融后会出现信号损失吗？

会。Firefly 和 Renilla 信号都可能在冻融后下降，其中 Firefly 通常更加敏感。条件允许时，应检测新鲜制备的裂解液；使用 Luciferase Assay Kit（LAK，Cat. #9048）时，在样品状态不理想的情况下加入 Firefly Assay Enhancer 100X（FAE，Cat. #7208）可以帮助提高 Firefly 信号恢复。

问：如果经过优化后 Firefly 信号仍然较弱，该怎么办？

如果细胞密度、转染条件和检测时间都已经优化，但 Firefly 信号仍然较弱，可以考虑增加报告质粒用量或延长表达时间。在 Luciferase Assay Kit（LAK，Cat. #9048）中加入 Firefly Assay Enhancer 100X（FAE，Cat. #7208），还可以在许多检测体系中进一步增强 ATP 依赖性的 Firefly 信号。

问：验证载体所需的最低倍数诱导是多少？

一个实际可用的标准是：经过 Firefly/Renilla 归一化（Firefly/Renilla 比值）后，相对于阴性对照载体至少达到 3–5 倍诱导。

问：阴性对照载体是必需的吗？还是只使用未转染细胞即可？

强烈建议使用包含转录沉默或最小启动子的阴性对照载体，因为它可以更准确地反映质粒骨架和检测系统产生的背景信号。未转染细胞只能控制培养板和培养基的背景，可能会低估实际检测背景。

问：阴性对照载体应该产生零信号，还是仅产生较低的基础信号？

预期会存在较低的基础信号；最小或“空白”启动子通常会表现出一定程度的漏表达，因此阴性对照应产生较低但非零的背景信号。